酪酸は、カコの代謝調節とは無関係に細胞のマグネシウム吸収を減少させます - 広東ボールドフロンティアテクノロジーズ株式会社

Scientific Reports volume 12、記事番号: 18551 (2022) この記事を引用

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腸内細菌による食物繊維の消化は、腸内ミネラル吸収 [例、カルシウム (Ca2+) およびマグネシウム (Mg2+)] を刺激することが示されています。局所的な pH と短鎖脂肪酸 (SCFA) 濃度が二価カチオンの吸収を決定することが示唆されていますが、正確な分子機構はまだ不明です。したがって、この研究は、腸の Mg2+ 吸収に対する SCFA の影響を決定することを目的としました。我々は、結腸内の酪酸濃度が野生型マウスの血清 Mg2+ レベルと負の相関があることを示します。さらに、酪酸ナトリウムは Caco-2 細胞における Mg2+ の取り込みを有意に阻害しましたが、Ca2+ の取り込みは影響を受けませんでした。 Na-酪酸塩は総ATP生成速度を大幅に低下させ、AMP活性化プロテインキナーゼ（AMPK）のリン酸化を増加させましたが、酪酸塩によるMg2+取り込みの阻害がこれらの結果に先行しました。重要なことに、電気生理学的検査により、細胞内酪酸がヘテロマー Mg2+ チャネル複合体である一過性受容体電位メラスタチン (TRPM)6/7 の活性を直接低下させることが実証されました。細胞の酪酸塩の取り込みをブロックすると、Mg2+ 取り込みに対する阻害効果が防止され、酪酸塩が細胞内で作用することが実証されました。私たちの研究により、酪酸塩が代謝調節とは独立して機能する腸内 Mg2+ 取り込みの新規調節因子であることが特定されました。この発見は、ミネラル吸収の調節における微生物発酵の役割をさらに強調しています。

腸内でのマグネシウム (Mg2+) の吸収は、さまざまな吸収経路によって促進されます1。受動的傍細胞輸送は小腸で起こりますが、結腸での能動輸送は、頂端側の一過性受容体電位メラスタチン（TRPM）カチオンチャネルファミリーのチャネルであるTRPM6およびTRPM7、およびサイクリンM4（CNNM4）によって促進されます。腸細胞の側底側にある4。これまでのところ、腸の Mg2+ 吸収を調節する因子についてはほとんど知られていません。

2 型糖尿病 (T2DM)、高血圧、心血管疾患、プロトンポンプ阻害剤 (PPI) 誘発性低マグネシウム血症など、Mg2+ 欠乏症の有病率が増加している疾患では、経口 Mg2+ 補給では血中 Mg2+ レベルを回復するには不十分なことがよくあります 5、6、7。したがって、腸の Mg2+ 吸収を刺激する代替治療オプションが緊急に必要とされています。腸内細菌による食物繊維の発酵が腸の Mg2+ 吸収を改善することが示されているため、食物繊維を使用して腸内細菌叢を標的にすることは有望な戦略です 8,9。しかし、その根底にある分子機構はまだ不明です。

考えられるメカニズムの 1 つは、複雑な食事性炭水化物の細菌発酵に由来する短鎖脂肪酸 (SCFA; 酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩) が Mg2+ 吸収の増加に関与しているということです 10。 SCFA が腸内微生物叢と宿主の間の重要なシグナル伝達分子として機能するという証拠が増えています 10、11、12。実際、SCFA は粘膜バリアの完全性を強化し、免疫細胞反応を調節し、さまざまな組織のコレステロール、脂質、およびグルコース代謝に影響を与えます 12。腸生理学との関連では、酪酸塩は結腸細胞の主要エネルギー源としての役割と、炎症や結腸直腸癌に対する保護効果について最も集中的に研究されています 13、14、15。

プレバイオティクス繊維（オリゴフルクトース、イヌリンなど）は、SCFAの産生を増加させ、結腸の管腔内のpHを低下させます。これらの要因は、さまざまな実験モデルで Mg2+ の溶解度および吸収に有益であることが示されました 8、16、17。したがって、Mg2+ 吸収に対する腸内微生物叢の刺激効果は、腸内腔の酸性化または能動輸送機構への影響のいずれかによって、SCFA に依存していると仮説が立てられています。これらの概念は現在の科学文献で広く採用されていますが、腸の Mg2+ 吸収に対する SCFA の直接的な影響はまだ解明されていません。

この研究では、SCFAがヒト結腸細胞株Caco-2におけるMg2+取り込みを調節する分子機構を解明し、野生型C57BL/6Jマウスにおける血清Mg2+レベルを結腸SCFA濃度と相関させることにより、腸のMg2+吸収に対するSCFAの生理学的役割を調査した。

微生物叢由来のSCFAがMg2+恒常性に影響を与えるかどうかを評価するために、野生型C57BL/6Jマウスの結腸SCFA濃度と血清Mg2+レベルの間の相関分析を実施しました（図1）。我々は、以前の研究中に収集された結腸サンプル中の SCFA の相対濃度を測定しました 18。線形回帰分析により、結腸酪酸濃度と血清 Mg2+ レベルの有意な逆相関が示されました (P < 0.05、r2 = 0.22) (図 1A)。血清 Mg2+ レベルと結腸の酢酸塩またはプロピオン酸塩の濃度の間に相関関係は見つかりませんでした (図 1B、C)。結腸SCFA濃度と血清Ca2+レベルの間に相関関係は見つかりませんでした（補足図S1）。

結腸内の酪酸濃度は、マウスの血清 Mg2+ レベルと負の相関があります。 (A-C) 以前に公開されたデータセット 18 から得られた結腸 SCFA 濃度と、25 匹の野生型雄 C57BL/6J マウスの血清 Mg2+ レベルに対して単純線形回帰分析を実行しました。酪酸塩（y = −2.24x + 1.52、r2 = 0.22、P < 0.05）（A）、酢酸塩（y = −0.05x + 1.22、r2 = 0.006）（B）、プロピオン酸塩（ y = 0.15x + 1.15、r2 = 0.003) (C)、および血清 Mg2+ レベル。データは個々のデータ点としてプロットされ、直線は関係を示します。 P < 0.05 は有意であるとみなされます。

結腸酪酸塩濃度と血清 Mg2+ レベルの間の逆相関の根底にあるメカニズムを説明するために、我々は、酪酸塩がヒト結腸細胞株 Caco-2 における Mg2+ 取り込みに影響を与えるかどうかを、25Mg 重同位体を使用して調査しました。 2、4、または 8 mmol/L 酪酸 Na で 20 分間インキュベートした細胞は、対照と比較して 25Mg2+ の取り込みが大幅に減少しました (それぞれ、100% vs. 88% ± 2 vs. 86% ± 4 vs. 72% ± 3)。、Ｐ＜０．０５）（図２Ａ）。注目すべきことに、用量反応効果は生理学的濃度範囲（8〜40 mmol/L）内でも観察されました（補足図S2）15。プロピオン酸ナトリウムおよび酢酸ナトリウムとインキュベートした細胞でも、25Mg2+取り込みの同様の減少が観察されました（補足図S2）。 8 mmol/L という低生理学的濃度を使用して、さらなる実験が行われました。酪酸ナトリウムの阻害効果は時間依存性であり、8 mmol/L 酪酸ナトリウムでは、対照処理細胞と比較して 10 ～ 30 分間で 25Mg2+ の取り込みが大幅に低下しました（P < 0.05）（図 2B）。 45Ca2+取り込みは、Caco-2細胞における酪酸Na処理によって阻害されませんでした（補足図S2）。次に、酪酸ナトリウム（0 ～ 20 mmol/L）をマグネシウムグリーンと MgCl2 を含む緩衝液に添加し、酪酸ナトリウムが Mg2+ に十分に結合して Mg2+ マグネシウムグリーン結合媒介蛍光を減少させることができるかどうかをテストしました。酪酸ナトリウムの試験した濃度のいずれも、より低い蛍光強度をもたらしませんでした (図 2C)。我々のアッセイの対照として、マグネシウムグリーンおよび MgCl2 を含む緩衝液に 1 mmol/L ATP を添加すると、マグネシウムグリーン蛍光が 2 倍 (98% ± 10 対 46% ± 18、P < 0.05) および 2 mmol/L 減少しました。 ATP は蛍光を完全に消失させました (図 2D)。酪酸塩の効果が細胞内作用に依存しているかどうかを調べるために、モノカルボン酸トランスポーター 1 (MCT1) を介した酪酸塩の取り込みが、既知の MCT1 阻害剤フロレチン 19 によってブロックされました。以前の実験と同様に、8 mmol/L 酪酸ナトリウムと 20 分間インキュベートすると、25Mg2+ の取り込みが大幅に減少し (100% vs. 65% ± 5、P < 0.05)、この効果は 1 mmol/L フロレチンの添加によって無効になりました (65% ± 5 対 101% ± 10、P < 0.05) (図 2E)。

酪酸処理により、Caco-2 細胞における 25Mg2+ の取り込みが減少します。 (A) 濃度を増加させた酪酸ナトリウム (2 ～ 8 mmol/L) で 20 分間処理した後の Caco-2 細胞による 25Mg2+ の取り込み。データは平均 ± SEM を表します (n = 3、各実験は 3 回ずつ行われました)。 *P < 0.05 は、複数の検定のダネット補正を備えた一元配置分散分析を使用して、対照細胞と比較して統計的に有意であると考えられます。 (B) 8 mmol/L 酪酸ナトリウム (破線) またはコントロール (実線) で 30 分間処理した Caco-2 細胞による 25 Mg2+ 取り込みの時間経過。データは平均 ± SEM を表します (n = 3、各実験は 3 回ずつ行われました)。 *P < 0.05 は、スチューデントの t 検定を使用して、同じ時点での対照細胞と比較して統計的に有意であると見なされます。 (C、D) 酪酸ナトリウム (0 ～ 20 mmol/L) (C) および ATP (0 ～ 2 mmol/L) の濃度を増加させた 1 mmol/L MgCl2 緩衝液中の 2 μmol/L マグネシウムグリーンの蛍光強度) (D)。データは平均±SEMを表します（n = 4（C）およびn = 3（D）、各実験は二重で構成されました）。 (E) 8 mmol/L 酪酸 Na、または 8 mmol/L 酪酸 Na と 1 mmol/L フロレチンで 20 分間処理した後の Caco-2 細胞による 25 Mg2+ の取り込み。データは平均 ± SEM を表します (n = 3、各実験は 3 回ずつ行われました)。 *P < 0.05 は、複数の検定に対する Sidak の補正を備えた一元配置分散分析を使用して、対照細胞と比較して統計的に有意であると考えられます。

酪酸塩は結腸細胞の主なエネルギー源である 20,21 ため、我々は酪酸塩処理により細胞代謝が調節され 25Mg2+ の取り込みが低下するという仮説を立てました (図 3)。これをより詳細に調査するために、ATP 生成に関与する 2 つの主要な代謝経路であるミトコンドリアの酸化的リン酸化 (OXPHOS) と解糖に対する酪酸処理の影響を、Seahorse Xfe96 アナライザーを使用して調べました。 8 mmol/L 酪酸ナトリウムで細胞を処理すると、細胞外酸性化速度 (ECAR) が減少し (図 3A)、酸素消費速度 (OCR) が増加しました (図 3B)。 ATP 生成速度の定量化により、酪酸処理により解糖系 ATP 生成が大幅に減少し (52.71 ± 2.55 vs. 42.95 ± 2.13 pmol ATP/分/μg タンパク質、P < 0.05) (図 3C)、ミトコンドリア ATP 生成が増加したことが実証されました ( 23.70 ± 3.35 対 29.84 ± 3.17 pmol ATP/分/μg タンパク質、P < 0.05) (図 3D)。合わせて、酪酸処理により総ATP産生は有意に減少しました（76.41±2.06対72.79±2.78pmol ATP/分/μgタンパク質、P<0.05）（図3E）。対照的に、8 mmol / Lの酢酸塩またはプロピオン酸塩で細胞を処理すると、総ATP生産速度には影響しませんでしたが、解糖系のATP生産が減少し、ミトコンドリアATP生産が増加しました（補足図S3）。

酪酸処理は細胞代謝を調節することにより ATP 生成率を低下させます。 (A、B) コントロール (実線) または 8 mmol/L 酪酸ナトリウム (破線) で処理した Caco-2 細胞の細胞外酸性化速度 (ECAR) (A) および酸素消費速度 (OCR) (B) (最初の矢印)、続いて 2 µmol/L オリゴマイシン (ATP シンターゼの阻害剤として OXPHOS をブロック; 2 番目の矢印)、および 0.5 µmol/L ロテノンとアンチマイシン A の混合物 (それぞれミトコンドリア複合体 I および III の阻害剤として OXPHOS をブロック; 3 番目の矢印) ）、Seahorse Xfe96 アナライザーで測定し、対照細胞に対して正規化したもの。 1 つの代表的な実験の結果を示します。実験は 3 回繰り返しました。データは、条件ごとに 12 回反復した平均値 ± SEM を表します。 (C–E) 8 mmol/L 酪酸ナトリウムによる処理前 (基礎) および処理後 (誘導) の細胞の解糖 (C)、ミトコンドリア (D)、および総 (C) ATP 生成速度。 (C–E) に示されたデータは平均 ± SEM を表し、3 つの独立した実験からの個々のトレースから計算され、そのうち 1 つの実験の代表的なトレースが (A、B) に示されています。 *P < 0.05 は、対応のあるスチューデントの t 検定を使用した基礎と比較して統計的に有意であるとみなされます。

酪酸による総 ATP レベルの減少をさらに理解するために、AMP 活性化プロテインキナーゼ (AMPK) のリン酸化レベルを分析しました。 AMPK は細胞のマスターエネルギーセンサーであり、細胞内 ATP22 が低い条件下でリン酸化されます。 Caco-2 細胞を 8 mmol/L 酪酸 Na、25 mmol/L グルコース (ATP 産生を刺激するため)、または 2 μmol/L オリゴマイシン (ATP 産生を阻害するため) で 5、10、および 20 分間処理しました。

対照と比較して、酪酸処理は 5 分後に 1.2 倍高い AMPK リン酸化をもたらす傾向がありましたが (統計的に有意ではありません)、オリゴマイシン処理はほぼ 2 倍高い AMPK リン酸化をもたらしました (図 4A、D)。それでも、酪酸処理により、10分後にはほぼ1.5倍（図4B、E）、20分後には2倍（図4C、F）という有意に高いAMPKリン酸化が生じた。同様に、オリゴマイシン処理により、10 分 (図 4B、E) および 20 分 (図 4C、F) で一貫して高い AMPK リン酸化が生じました。逆に、ATP 産生を増加させることが知られているグルコース処理では、AMPK リン酸化が低下しましたが、これは 10 分後にのみ顕著でした (図 4A ～ F)。 AMPK によって調節される主要な下流シグナル伝達経路の 1 つは、直接の下流標的として S6K が関与する哺乳動物のラパマイシン標的 (mTOR) 経路です。活性化された AMPK は mTOR 経路を阻害するため、S6K のリン酸化レベルを同じ時点で調査しました。酪酸、グルコース、またはオリゴマイシンによる処理の効果は、5 分後の S6K リン酸化には観察されませんでした (図 4G、J)。しかし、酪酸処理により、S6Kリン酸化は10分後には2倍(図4H、K)、20分後には2.5倍(図4I、L)と有意に低下した。この後者の時点では、グルコース処理により、1.5倍という有意に高いS6Kリン酸化が生じた(図4I、L)。すべての元の生のウェスタンブロットデータは補足情報に示されています（補足図S4〜S5）。

酪酸処理は AMPK シグナル伝達に影響を与えます。 (A – C) 8 mmol/L 酪酸ナトリウム、25 mmol/L グルコース、または 2 μmol/L オリゴマイシンで処理した後の Caco-2 細胞溶解物の pAMPK (62 kDa) および総 AMPK (62 kDa) の代表的なイムノブロット画像5 分間 (A)、10 分間 (B)、20 分間 (C)。 (D – F) 8 mmol/L 酪酸ナトリウム、25 mmol/L での処理の 5 分 (D)、10 分 (E)、および 20 分 (F) 後の総 AMPK 発現レベルで補正された pAMPK 発現のデンシトメトリー分析グルコース、または 2 μmol/L オリゴマイシン。 (G – I) 8 mmol/L 酪酸ナトリウム、25 mmol/L グルコース、または 2 μmol/L オリゴマイシンで処理した後の Caco-2 細胞溶解物の pS6K (70 kDa) および総 S6K (70 kDa) の代表的なイムノブロット画像5分間(G)、10分間(H)、20分間(I)。 (J-L) 8 mmol/L 酪酸ナトリウム、25 mmol/L グルコースでの処理の 5 分 (J)、10 分 (K)、および 20 分 (L) 後の総 S6K 発現に対して補正された pS6K 発現のデンシトメトリー分析、または 2 μmol/L オリゴマイシン。データは平均 ± SEM を表します (n = 3、各実験は 3 回ずつ行われました)。 *P < 0.05 は、複数の検定のダネット補正を備えた一元配置分散分析を使用して、対照細胞と比較して統計的に有意であると考えられます。すべての元のイムノブロットを補足図に示します。 S4～S5。

酪酸処理による Mg2+ 取り込み阻害が AMPK シグナル伝達に依存しているかどうかを調べるために (図 5)、Caco-2 細胞を 8 mmol/L 酪酸 Na および/または 2 mmol で 5、10、および 20 分間処理しました。 /L AICAR、よく知られた AMPK 活性化化合物 24。以前の実験で観察されたように、酪酸処理により、すべての時点で 25Mg2+ の取り込みが大幅に低下しました（図 5A ～ C）。しかし、AMPKの活性化をもたらしたAICAR処理は、5分後の25Mg2+取り込みに影響を与えず（図5A）、10分後には25Mg2+取り込みが増加しました（図5B）。それでも、AICAR と酪酸塩の併用治療では、AICAR のみによる治療と比較して 25Mg2+ の取り込みが大幅に減少しました (図 5A ～ C)。続いて、細胞をオリゴマイシンで5、10、および20分間処理することにより、低い細胞内ATPレベルが25Mg2+の取り込みを直接阻害するかどうかを分析しました。５分間の酪酸処理では、２５Ｍｇ２＋の取り込みがほぼ１．５倍と有意に低下したが、５分間のオリゴマイシン処理の効果はなかった（図５Ｄ）。 10分後および20分後、酪酸およびオリゴマイシン処理は両方とも、25Mg2+の取り込みを著しく低下させた(図5E)。

酪酸処理により、ATP とは関係なく 25Mg2+ の摂取が減少します。 (A-C) 8 mmol/L 酪酸 Na および/または 2 mmol/L AICAR で 5 分間 (A)、10 分間 (B)、および 20 分間 (C) 処理した後の Caco-2 細胞による 25Mg2+ の取り込み。データは平均 ± SEM を表します (n = 3、各実験は 3 回ずつ行われました)。 *P < 0.05 は、複数の検定に対する Sidak の補正を備えた一元配置分散分析を使用して、対照細胞と比較して統計的に有意であると考えられます。 (D – E) 8 mmol/L 酪酸ナトリウムまたは 2 μmol/L オリゴマイシンで処理した 5 分後の Caco-2 細胞による 25Mg2+ 取り込み (D)。 8 mmol/L 酪酸 Na または 2 μmol/L オリゴマイシンで処理した後の 5、10、および 20 分後の Caco-2 細胞による 25 Mg2+ 取り込みの時間経過 (E)。データは平均 ± SEM を表します (n = 3、各実験は 3 回ずつ行われました)。 *P < 0.05 は、複数の検定のダネット補正を備えた一元配置分散分析を使用して、同じ時点での対照細胞と比較して統計的に有意であると考えられます。

続いて、Mg2+ 摂取に対する酪酸塩の潜在的な直接効果を調査しました (図 6)。過去 10 年間にわたり、ヘテロマー TRPM6/7 チャネルが結腸における Mg2+ 吸収の主要な調節因子として確立されてきました 2,3。 TRPM6/7 が酪酸処理で阻害される Mg2+ 取り込みに関与しているかどうかを調べるために、Caco-2 細胞を 8 mmol/L 酪酸 Na および TRPM6/7 阻害剤 NS8593 (30 μmol/L) で 10 分間処理しました 3。重要なことに、Caco-2 細胞を酪酸塩および NS8593 で処理すると、NS8593 単独の効果と同様に、25Mg2+ 取り込みが 4 倍低くなりました (100% vs. 24% ± 2、P < 0.05)。これは、酪酸処理が TRPM6/7 を介してその効果を発揮していることを示唆しています (図 6A)。したがって、酪酸塩が TRPM6/7 チャネル活性に直接影響を与える可能性があるかどうかを調査しました。 TRPM6/7 を一過性にトランスフェクトしたヒト胎児腎臓 (HEK293) 細胞に、パッチピペット溶液中の 8 mmol/L 酪酸 Na を使用した全細胞パッチクランプを適用しました。細胞内酪酸ナトリウムに曝露された細胞は、対照と比較して + 80 mV および - 80 mV で経時的に有意に低い電流密度を示しました (759 ± 159 vs. 433 ± 53 pA/pF、P < 0.05 および - 45 ± 10 vs. -それぞれ18±4pA/pF、P<0.05）（図6B、C）。注目すべきことに、TRPM6の電流密度は影響を受けなかったので、細胞内酪酸Naの効果は、TRPM7の電流密度を特に低下させました（補足図S6）。電気生理学的記録のすべての元の痕跡は補足情報に示されています（補足図S7〜S9）。

細胞内酪酸は TRPM6/7 チャネル活性の低下をもたらします。 (A) 8 mmol/L 酪酸ナトリウムおよび/または 30 μmol/L NS8593 で処理した 10 分後の Caco-2 細胞による 25 Mg2+ 取り込み。データは平均 ± SEM を表します (n = 3、各実験は 3 回ずつ行われました)。 * P < 0.05 は、複数の検定に対する Sidak の補正を備えた一元配置分散分析を使用して、対照細胞と比較して統計的に有意であると考えられます。 (B、C) TRPM6/7 トランスフェクト (HA-mTRPM7 pCINeo IRES GFP および HA-hTRPM6 pCINeo IRES GFP) HEK293 細胞において、-80 mV および + 80 mV で経時的に測定された全細胞電流 (丸、n = 9) ) または細胞内ピペット溶液に 8 mmol/L 酪酸 Na (四角、n = 11) を加えたもの (B)。細胞内ピペット溶液中に 8 mmol/L 酪酸ナトリウム (酪酸ナトリウム) を含まない場合 (対照) またはある場合 (C) の電流振幅の棒グラフ。データは平均値 ± SEM を表します。 *P < 0.05 は、スチューデントの t 検定を使用して、対照細胞と比較して統計的に有意であるとみなされます。

私たちの研究は、細菌発酵に由来する短鎖脂肪酸である酪酸が、代謝調節の変化に先立ち、腸内での TRPM6/7 媒介 Mg2+ 取り込みを減少させることを実証しています。この結論は、以下の結果に基づいています。(i) 野生型マウスでは、結腸酪酸濃度は血清 Mg2+ レベルと負の相関があります。 (ii) 酪酸処理により、ヒト結腸細胞株 Caco-2 における 25Mg2+ の取り込みが低下します。 (iii) 酪酸と、酪酸輸送体 MCT1 の特異的阻害剤であるフロレチンによる Caco-2 細胞の併用処理は、この 25Mg2+ 取り込みの低下を防ぎます。（iv）酪酸塩およびTRPM6/7ブロッカーであるNS8593によるCaco-2細胞の処理は、NS8593単独によるCaco-2細胞の処理と同様に、25Mg2+の取り込みが4分の1に低下する。 (v) 細胞内酪酸により TRPM6/7 チャネル活性が大幅に低下します。

腸内微生物叢による食事性炭水化物の発酵は、ミネラル吸収の促進と関連しています25。ヒトの結腸では、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩が約 60:20:20 のモル比で生成され、濃度は 20 ～ 140 mmol/L の範囲になります 10,26。酢酸塩とプロピオン酸塩は、さまざまな組織における脂質、グルコース、およびコレステロール代謝の重要なモジュレーターであるのに対し、酪酸塩は限られた全身機能しか発揮しませんが、結腸の恒常性の重要なモジュレーターです10、15、25。ここで我々は、野生型 C57BL/6J マウスの血清 Mg2+ レベルと相関するのは、酢酸塩およびプロピオン酸塩ではなく、結腸酪酸塩濃度のみであることを報告します。結腸では、酪酸は腸細胞の主要なエネルギー源であり、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤として機能します15。これらの機能は、モノカルボン酸トランスポーター (MCT1 など) による酪酸吸収に依存しています 26,27。我々は今回、酪酸トランスポーターMCT1の特異的阻害剤であるフロレチンが25Mg2+取り込みに対する酪酸の阻害効果を無効にするため、酪酸が細胞内機構を介して25Mg2+取り込みの減少をもたらすことを実証する。具体的には、我々の結果は、細胞内の酪酸がTRPM6/7チャネルの阻害によって25Mg2+取り込みに対する負のフィードバック機構を開始することを示唆している。

我々は、全細胞パッチクランプ実験により、細胞内酪酸により、未処理細胞と比較してTRPM6/7電流が1.5倍低いことが示されました。脂肪酸はイオンチャネル活性の細胞内モジュレーターとして以前に報告されており、一過性受容体電位（TRP）チャネル上で（アンタ）アゴニストとして作用することができます28、29、30、31。アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサヘキサエン酸などの多価不飽和脂肪酸は、チャイニーズハムスター卵巣細胞の TRPM8 電流を阻害することが示されています 32。さらに、40 μmol/L リノール酸 (LA) は、ショウジョウバエ S2 細胞の TRPM8 および TRPV1 チャネルの負および正の膜電位の両方で電流を大幅に減少させました 33。同様に、10 µmol/L LA および EPA は、HEK293 細胞においてカプサイシンによって誘発される TRPV1 電流をそれぞれ 82% および 48% 阻害しました 34。これらの脂肪酸は、リガンド（カプサイシンなど）によって引き起こされる TRPV1 電流を競合的に阻害し、共通の結合部位が示唆されています 34。これらの研究は長鎖脂肪酸を調査したものですが、我々のデータはSCFA酪酸についても同様のメカニズムを示唆しています。

一般に、TRPM6/7 活性に対する酪酸の影響を説明するには 2 つのメカニズムが考えられます。SCFA はチャネルに直接結合するか、脂質二重層に影響を与える可能性があります 28,35。酪酸は、腸上皮細胞上で GPR43 (FFAR2) などの G タンパク質共役受容体 (GPCR) のリガンドとして機能します 10,13。酪酸による GPR43 の活性化はホスホリパーゼ C (PLC) 活性を刺激し、これによりホスファチジルイノシトール 4,5-二リン酸 (PIP2) がジアシルグリセロール (DAG) とイノシトール三リン酸 (IP3) に変換されます 36。 TRPM7活性はPIP237、38、39の加水分解によって負に制御されるため、酪酸は細胞表面膜でのGPR43の活性化を介したPIP2の加水分解によって間接的にTRPM7活性を阻害すると仮説が立てられる。しかし、TRPM6/7 チャネルに対する酪酸の阻害効果は細胞内への酪酸の適用に特異的であったため、このメカニズムは考えられません。酪酸による TRPM6/7 活性の負の制御は、チャネルとの直接相互作用によって、または PKC/RACk1 経路などの阻害経路を介した間接的な制御によって引き起こされる可能性があります 40。したがって、TRPM6/7 チャネル内に酪酸の相互作用部位があるかどうかを特定するには、構造研究が必要です。

我々は、酪酸塩によるMg2+取り込みの減少が代謝調節に対する酪酸塩治療の先行効果であることを示しているが、ATPレベルの低下が酪酸塩治療による25Mg2+取り込みに対する長期阻害効果に寄与していることを除外することはできない。酪酸依存性の 25Mg2+ 取り込み阻害は、ATP 産生に対する酪酸処理の効果に先行しましたが、オリゴマイシン処理による ATP 産生の遮断も、10 分および 20 分後の 25Mg2+ 取り込みの有意な低下をもたらしました。これらの時点で、酪酸処理とオリゴマイシン処理の両方により、AMPK のリン酸化が大幅に増加し、ATP が低い細胞内状態が確認されました。この阻害は、メトホルミン 41 などの AMPK 活性化薬で観察されるものと同様です。メトホルミンまたはAICARとの24時間のプレインキュベーションにより、Caco-2細胞および腎臓細胞株mDCT1541における25Mg2+の取り込みが有意に減少した。我々の結果は、細胞内ATPレベルが低いとMg2+摂取量が減少することを示しています。したがって、酪酸塩は、TRPM6/7 活性に急激に影響を与えることと、遅延応答で細胞内 ATP レベルを低下させることにより、Mg2+ 取り込みの減少において二重の役割を果たしている可能性があります。

我々の結果は、酪酸塩が食物繊維摂取時の結腸での Mg2+ 吸収に負のフィードバック機構を提供していることを示唆しています。食物繊維は腸内腔を酸性化し、それによって結腸内の Mg2+ の溶解度を高めることが知られています 8、9、16、17、42。管腔内のイオン化 Mg2+ 濃度が高い場合、Mg2+ の吸収を安定に保つために結腸内の Mg2+ の透過性を低下させる必要があります。食物繊維も微生物の多様性を増加させ、その後酪酸塩の生成を増加させることを考えると、酪酸塩は Mg2+ チャネル活性を低下させる優れたシグナル伝達分子を提供します。食物繊維発酵時には酪酸濃度が変動するため 45,46、TRPM6/7 チャネルが常に阻害されるわけではありません。 TRPM6/7 チャネルを介した Mg2+ 吸収が結腸近位で高く、この腸セグメントが酪酸生成細菌によって支配されている 10,47,48 という事実を考慮すると、酪酸はこのセグメントにおける Mg2+ 吸収の負の調節因子として機能する可能性があります。以前の研究では、酪酸塩の補給は、1 日後と 14 日後の酪酸塩投与マウスと対照投与マウスの間で血清 Mg2+ 濃度や糞便 Mg2+ 排出に差を生じませんでしたが 49、我々の相関分析では、結腸酪酸塩含有量が血清 Mg2+ 濃度と逆相関していることが実証されました。生理学的に適切な環境における Mg2+ レベル。

私たちの研究は、SCFA が腸の Mg2+ 取り込みにどのような影響を与えるかについて分子的な洞察をもたらした最初の研究です。我々は、酪酸処理が代謝の影響に先立って、TRPM6/7 チャネルの迅速な阻害によって 25Mg2+ 取り込みの減少をもたらすことを示します。特に Mg2+ 欠乏症の患者は、Mg2+ 吸収を最適に高めるために酪酸塩のモル比を低くすることで恩恵を受ける可能性があります。

血清電解質濃度および結腸内容物 (発酵ブロス) からの有機酸濃度は、Gommers et al.18 によって詳細に記載されている野生型雄 C57BL/6J マウスで測定されました。この研究は、ナイメーヘン・ラドボウド大学の動物倫理委員会（RU DEC 2015-0112）およびオランダ動物実験中央委員会（CCD、AVD103002016382）によって承認されました。この研究は、関連するガイドラインおよび規制に従って実施されました。この研究はARRIVEガイドラインに従って実施されました。

有機酸濃度は、マウスの結腸内容物 (発酵ブロス) で測定されました。つまり、結腸内容物を 1 mol/L 過塩素酸 (HClO4、Sigma-Aldrich、米国) で 4 倍に希釈して有機酸を放出しました。発酵ブロス中のタンパク質および脂肪を超音波処理によって沈殿させ、20,000×gで10分間の遠心分離によって除去した。 SCFA を含む有機酸は、UV および屈折率 (RI) 検出を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー (HPAEC) によって測定されました。 25 μL の上清を、2 つの Rezex ROA 有機酸 H+ 分析カラム (Phenomenex、米国) と直列に接続されたガードカラムに注入しました。有機酸を、5 mmol/L 硫酸 (H2SO4) を用いて、流速 0.60 mL/min で均一濃度で溶離しました。カラムオーブンを 60 °C の温度に保持しました。データ分析は、Chromeleon ソフトウェアバージョン 7.2 (Thermo Scientific) を使用して行われました。定量分析は、有機酸の標準物質 (Sigma-Aldrich、米国) を使用して実行されました。

血清 Mg2+ 濃度は、メーカーのプロトコール (Roche/Hitachi、東京、日本) に従って比色キシリジル IL ブルーアッセイキットを使用して測定し、Bio-Rad Benchmark Plus マイクロプレート分光光度計 (BioRad、カリフォルニア州ハーキュリーズ) で 600 nm で測定しました。アメリカ合衆国）。血清 Ca2+ レベルは、o-クレゾールフタレインコンプレクソン法 50 を使用して測定されました。簡単に説明すると、o-クレゾールフタレイン発色試薬 (Sigma、Zwijndrecht、オランダ) をサンプルおよび標準とともにインキュベートし、吸光度を 570 nm で直ちに測定しました。 Mg2+ と Ca2+ の両方の測定は、Precinorm U (Roche、バーゼル、スイス) を対照として使用して実行されました。

ヒト癌細胞株 Caco-2 (ATCC® HTB-37™、継代数 4 ～ 21) を、25 mmol/L HEPES および 4.5 g/L グルコース (DMEM、ロンザ、ベルギー) を含むダルベッコ変法イーグル培地で維持しました。 4 mmol/L l-グルタミン (Sigma-Aldrich、セントルイス、米国)、5% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS、HyClone、GE Healthcare Life Sciences、イリノイ州、米国)、1% (v/v) 添加) 非必須アミノ酸 (Biowest、ミズーリ州、米国)、および 1% (v/v) ペニシリン – ストレプトマイシン (Gibco、ニューヨーク、米国)。細胞は 5% (v/v) CO2 を含む 37 °C のインキュベーター内で維持され、21 日間培養されるか、別途記載されています。培養培地を一日おきに交換し、約80%のコンフルエンシーに達したときに細胞を週に1回継代した。細胞は 0.5 × 105 細胞/cm2 の密度で播種されました。ヒト胚性腎臓細胞 (HEK293; ATCC®-1573™、継代数 11 ～ 18) を、10% (v/v) FBS、10 μL/mL の非必須アミノ酸、および 2 mmol/L l を添加した DMEM で増殖させました。 -グルタミン。

Mg2+ 結合に対する酪酸ナトリウムの影響は、細胞不透過性マグネシウムグリーンペンタカリウム塩 (Life Technologies、オレゴン州、米国) を使用して調査されました。マグネシウムグリーンの 100 μmol/L ストック溶液を MQ で調製しました。ワーキングバッファーには、2 µmol/L マグネシウムグリーン色素、115 mmol/L KCl、20 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L EGTA、および 10 mmol/L Tris-HCL、pH 7.2 が含まれていました。 Mg2+ に対する色素親和性は、最初に酪酸 Na の非存在下で 0 ～ 10 mmol/L MgCl2 の濃度範囲でテストされ、Kd ～ 1.0 mmol/L が得られました (標準曲線、データは示されていません)。続いて、0 ～ 20 mmol/L の範囲の酪酸 Na を作業緩衝液に添加しました (NaCl で浸透圧を調整)。蛍光は、Tecan I-control Infinite200 pro (Thermo Fisher Scientific) で吸収 500 nm、発光 535 nm で測定しました。

Caco-2 細胞による Mg2+ の取り込みは、安定な 25Mg 同位体 (Cortecnet、Voisins Le Brettoneux、フランス) を使用して測定しました。非放射性安定同位体 25Mg (自然存在量 10%) を使用しました。これは、24Mg (自然存在量 80%) および 26Mg (自然存在量 10%) と区別できます。この目的のために、細胞から一晩かけて Mg2+ と血清を枯渇させました。実験の開始時に、細胞をあらかじめ温めた塩基性取り込み緩衝液（mmol/L）：125 NaCl、5.0 KCl、0.5 CaCl2、0.5 Na2HPO4、0.5 Na2SO4、15 HEPES、NaOHでpH 7.5に調整したもので1回洗浄しました。次に、1.0 mmol/L 25MgO を含む基本取り込みバッファー 500 μL を細胞に添加しました。各時点で、細胞を氷冷したリン酸緩衝食塩水（PBS）で 3 回洗浄し、HNO3（≥ 65%; Sigma-Aldrich、シュタインハイム、ドイツ）中で 65 °C で 15 分間溶解しました。細胞による 25 Mg2+ の取り込みは、誘導結合血漿質量分析 (ICP-MS) 分析 (ナイメーヘンのラドバウド大学理学部) によって測定されました。計算は、25Mg と総 Mg の間の正規化された比率 (24Mg + 25Mg + 26Mg) に基づいて実行されました (細胞内 25Mg の増加により、その通常の存在量と比較して同位体比が変化します)。

Caco-2 細胞を 25 μmol/L BAPTA-AM (1,2-ビス(o-アミノフェノキシ) エタン-N,N,N',N'-四酢酸アセトキシメチルエステル) (Invitrogen、ユージーン、米国) で前処理しました。 37℃で30分。次に、細胞を温かいクレブス・ヘンゼライト重炭酸塩 (KHB) 緩衝液 (mmol/L): 110 NaCl、5 KCl、1.2 MgCl2、0.1 CaCl2、10 Na-acetate、2 NaHPO4、および 20 HEPES、pH 7.4 (mmol/L) で 1 回洗浄しました。 NaOH)、電位依存性カルシウムチャネルの阻害剤、10 μmol/L フェロジピンおよび 10 μmol/L ベラパミル、および 1 μCi/mL 45Ca (ロット: 17M431A、Perkin Elmer、MA、USA) を補充した KHB 緩衝液で 10 分間インキュベートしました。）37℃で。続いて、０．５ｍｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２および１．５ｍｍｏｌ／ＬＬａＣｌ３を補充した氷冷ＫＨＢ緩衝液で細胞を３回洗浄することによってアッセイを停止した。細胞を Opti-Flour O (Perkin Elmer, MA, USA) と混合した 0.05% (v/v) SDS 溶液で回収しました。次いで、液体シンチレーションカウンター(Hidex SL 600、Hidex)によって45Ca取り込みを定量した。

細胞外酸性化速度 (ECAR) および酸素消費速度 (OCR) は、Seahorse XFe96 細胞外流束分析装置 (Agilent Technologies、テキサス州、米国) を使用して測定しました。 Seahorse V3 培養プレートを 50 μg/mL フィブロネクチンでコーティングしました。続いて、Caco-2 細胞を 0.5 × 105 細胞/cm2 の密度で播種し、2 日間培養しました。測定前に、細胞を一晩血清飢餓状態にしました。実行の 1 時間前に、細胞を PBS で 1 回洗浄し、Agilent Seahorse XF DMEM 培地 pH 7.4 (103575-100; 5 mmol/L HEPES 含有、フェノールレッドおよびピルビン酸ナトリウム不含、Agilent Technologies、テキサス州、米国) を添加してインキュベートしました。 10 mmol/L グルコース、37 °C、CO2 なし。基礎測定後、細胞に 8 mmol/L 酪酸 Na、酢酸 Na、またはプロピオン酸 Na を急性注射し、続いて 2 μmol/L オリゴマイシン A、および 0.5 μmol/L ロテノンと 0.5 μmol/L アンチマイシンの混合物を投与しました。 A. 1 つの測定サイクルは、3 分間のインキュベーション時間と 3 分間の測定時間で構成されています。 OCR および ECAR 値は、総タンパク質含有量に対して正規化されました。 ATP 生成速度は、White et al.51 の記載に従って計算されました。

細胞は、以下を含む氷冷溶解バッファー (mmol/L) で溶解しました: 50 Tris-HCl、1 EGTA、1 EDTA、10 グリセロリン酸ナトリウム、1 オルトバナジン酸ナトリウム、フッ化ナトリウム 10、ピロリン酸ナトリウム 10、スクロース 270、および NaCl 1% (v/v) Triton X-100 と次のプロテアーゼ阻害剤のカクテル: PMSF (1 mmol/L)、アプロチニン (1 μg/mL)、ロイペプチン (5 μg/mL)、ペプスタチン (1 μg/mL) mL）。タンパク質濃度は、メーカーのプロトコールに従って Bradford を使用して測定しました (Sigma Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国)。サンプルを、100 mmol/L ジチオスレイトール (DTT) を含む laemmli 緩衝液中で 37 °C で 30 分間変性し、SDS-PAGE (20 μg) に供し、ポリビニリデン (PVDF) 膜に転写しました。 1 × トリス緩衝食塩水 (TBS)-T (0.1% (v/v) Tween-20 を含む TBS) に溶解した 5% (w/v) 脱脂粉乳 (NFDM) で膜を 45 ～ 60 分間ブロックしました。室温で1分。続いて、膜を一次抗体（ウサギ pAMPKα (Thr172) (1:1000、Cell Signaling Technologies、米国ダンバーズ、#2535)、ウサギ AMPKα (1:1000、Cell Signaling Technologies、米国ダンバース) を用いて 4 °C で一晩免疫ブロットしました。、#5831)、ウサギ pS6K(Thr389) (1:1000、Cell Signaling Technologies、米国ダンバーズ、#2708)、ウサギ S6K (1:1000、Cell Signaling Technologies、米国ダンバース、#9234)。広く特性評価されており、この分野で最も広く使用されているものの1つであるため、材料を節約するために抗体とのハイブリダイゼーションの前にメンブレンを切断しました。これは、エッジが目的のタンパク質の予想サイズから約20 kDaになるように実行されました。翌日、ブロットを TBS-T で 3 回洗浄して未結合の一次抗体を除去し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ (HRP) 結合二次抗体 (PO α-ウサギ 1:10,000、Sigma Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) とインキュベートしました。 TBS-T で 3 回洗浄した後、タンパク質を化学発光試薬 (SuperSignal West femto/pico、Thermo Scientific、ウォルサム、米国) で可視化し、Bio-Rad Chemidoc XRS で処理しました。最適な露光時間を決定し、特に露光不足または過剰を防ぐために各ブロットに適用しました。バンド密度は、Image J ソフトウェア (バージョン 2.0) を使用した濃度分析で定量化されました。

HEK293 細胞を、リポフェクタミン 2000 (Invitrogen) を 1:2 の DNA:リポフェクタミン比で使用して、0.5 μg のマウス TRPM7 (HA-mTRPM7 pCINeo IRES GFP) プラスミドおよび 0.5 μg のヒト TRPM6 (HA-hTRPM6 pCINeo IRES GFP) プラスミドでトランスフェクトしました。 –48時間。単一トランスフェクションの場合、DNA:リポフェクタミン比 1:2 のリポフェクタミン 2000 (Invitrogen) を使用して、HEK293 細胞を 1 μg のヒト TRPM6 (HA-hTRPM6 pCINeo IRES GFP) または 1 μg のマウス TRPM7 (HA-mTRPM7 pCINeo IRES GFP) でトランスフェクトしました。 36 ～ 48 時間。実験の開始前に、50μg/mLのフィブロネクチン(Roche、マンハイム、ドイツ)でコーティングされたカバーガラス上に細胞を播種した。細胞を室温の記録チャンバーに置き、蛍光レポーター (GFP) の強度に基づいて選択しました。すべての実験は、EPC-10 増幅器と Patchmaster ソフトウェア (HEKA ElectroniK GmbH、ランブレヒト、ドイツ) を使用して実施および分析されました。サンプリング間隔は 200 ms に設定され、データは 2.9 kHz でローパスフィルター処理されました。パッチクランプピペットは、薄肉ホウケイ酸ガラス (Harvard Apparatus、March-Hugstetten、ドイツ) から引き抜かれ、150 mmol/L NaCl、10 mmol/L Na2EDTA、および 10 mmol/L Na2EDTA を含むピペット溶液で満たされた場合、1 ～ 3 MΩ の抵抗を示しました。 mmol/L HEPES、NaOH で pH 7.3 に調整。細胞外溶液は、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳおよび１ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２を含有し、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整した。酪酸ナトリウムの 400 mmol/L ストック溶液を MilliQ (MQ) で調製し、ピペット溶液中の最終濃度は 8 mmol/L 酪酸ナトリウムでした。直列抵抗補償はすべての実験で 75 ～ 95% に設定されました。 0 mV の保持電位から、-100 から + 100 mV までの直線的な 500 ms の電圧ランプを 2 秒ごとに適用しました。電流密度は、Igor Pro ソフトウェア（Wavemetrics、オレゴン州、米国）を使用して電流振幅をセル容量に対して正規化することによって得られました。棒グラフは、セルへの慣らし運転から 200 秒後に + 80 および - 80 mV で得られた電流密度を示します。

結果は、平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) として表示されます。特に明記しない限り、2 つのグループ間の比較は、シャピロ-ウィルク検定を使用して正規分布を検定した後、対応のないスチューデントの t 検定によって分析されました。 Seahorse アナライザーの繰り返し測定の性質により、これらは対応のあるスチューデントの t 検定で特別にテストされました。 2 つ以上のグループの比較は、一元配置分散分析と、それに続くダネットまたはシダックの事後検定によって分析し、多重比較を補正しました。相関分析は単純な線形回帰を使用して実行されました。 GraphPad Prism (バージョン 8) を使用して統計分析を実行しました。

この研究の結果を裏付ける生データは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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マグネシウムグリーンに関する技術支援について、オランダ、ナイメーヘンのラドボウド大学医療センター、放射線科・核医学科のデジレ・ボス氏と、オランダ、ナイメーヘンのラドボウド大学医療センター、トランスレーショナル代謝研究所のダーン・パネマン氏に感謝します。実験とタツノオトシゴの測定。この研究は、オランダ科学研究機構 (J. Hoenderop、NWO VICI 016.130.668 および J. de Baaij、NWO VENI 016.186.012) からの助成金によって支援されました。

Jeroen HF de Baaij と Joost GJ Hoenderop の著者も同様に貢献しました。

生理学部門、ラドバウド分子生命科学研究所 (RIMLS)、ラドバウド大学医療センター (Radboudumc)、私書箱 9101、6500 HB、ナイメーヘン、オランダ

リザンヌ・MM・ゴマーズ、ピーター・A・リアメイカース、ジェニー・ファン・デル・ワイスト、サラ・R・ロイグ、アナスタシア・アデラ、メリッサ・A・E・ファン・デ・ヴァル、レネ・J・M・ビンデルス、ジェロン・HF・デ・バーイ、ヨースト・G・J・ホエンロップ

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LMMG、JvdW、JHFdB、JGJH が企画した調査。 LMMG、JvdW、SRR、PAL、RJMB、JHFdB、JGJH が分析および解釈したデータ。 LMMG、JvdW、SRR、MvdW、AA が調査を実施しました。 LMMG、JvdW、PAL、JHFdB、JGJH がこの論文を執筆しました。すべての著者は研究データにアクセスし、最終原稿をレビューして承認しました。

Joost GJ Hoenderop への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Gommers、LMM、Leermakers、PA、van der Wijst、J. 他酪酸塩は、Caco-2 ヒト結腸細胞の代謝調節とは独立して、細胞のマグネシウム吸収を減少させます。 Sci Rep 12、18551 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-21683-6

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受信日: 2022 年 3 月 1 日

受理日: 2022 年 9 月 30 日

公開日: 2022 年 11 月 3 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21683-6

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